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技術(shù)簡(jiǎn)介

      染色體步移(Chromosome walking)，又稱為基因組步移（Genome walking），是指由生物基因組或基因組文庫(kù)中的已知序列出發(fā)，逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目標(biāo)序列的方法。對(duì)于已經(jīng)完成基因組測(cè)序的模式生物種(如人、小鼠、線蟲(chóng)、水稻、擬南芥等)，可直接從數(shù)據(jù)庫(kù)中輕松的找到已知序列的側(cè)翼序列。但是目前為止，自然界中大多數(shù)生物基因組DNA序列仍未知，要想知道一個(gè)已知區(qū)域兩側(cè)的DNA序列，染色體步移無(wú)疑是一種非常有效的方法。

      TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR)，即熱不對(duì)稱PCR，又叫巢式PCR，克服了傳統(tǒng)染色體步移法（如構(gòu)建文庫(kù)步移法、反向PCR法、連接接頭法等）操作復(fù)雜、非特異性擴(kuò)增、連接效率低等弊端。其原理是，根據(jù)已知 DNA 序列，分別設(shè)計(jì)三條同向且退火溫度較高的特異性引物(SP Primer)，與經(jīng)過(guò)獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行熱不對(duì)稱 PCR 反應(yīng)。通常情況下，其中至少有一種兼并引物可以與特異性引物之間利用退火溫度的差異進(jìn)行熱不對(duì)稱 PCR 反應(yīng)，一般通過(guò)三次巢式 PCR 反應(yīng)即可獲取已知序列的側(cè)翼序列。如果一次實(shí)驗(yàn)獲取的長(zhǎng)度不能滿足實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，還可以根據(jù)第一次步移獲取的序列信息，繼續(xù)進(jìn)行側(cè)翼序列獲取。

應(yīng)用領(lǐng)域

1. 鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)，鑒定轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)致的外源基因的插入位點(diǎn)； （2）根據(jù)基因的已知片段、EST或插入的轉(zhuǎn)座子序列克隆目的基因，分離基因的啟動(dòng)子及調(diào)控元件；

2. 用于人工染色體PAC、YAC和BAC的片段搭接；

3. 構(gòu)建圖位克隆中的重疊群；

4. 轉(zhuǎn)化標(biāo)記輔助育種中的STS或SCAR標(biāo)記等

服務(wù)內(nèi)容

服務(wù)流程

1.已知序列的驗(yàn)證

根據(jù)客戶提供的已知序列設(shè)計(jì)引物，以材料的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證已知序列是否在模板中存在。

2. 5' 或3' 未知序列的獲取

根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)3條高退火溫度的特異性下游或上游引物，同時(shí)使用低退火溫度的簡(jiǎn)并引物,利用特異性引物與簡(jiǎn)并引物之間退火溫度的差異進(jìn)行不對(duì)稱PCR，通過(guò)三次巢式PCR獲取側(cè)翼序列。

3. 對(duì)獲取的序列進(jìn)行驗(yàn)證

獲取側(cè)翼未知序列后，我們將分別在已知和未知序列上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,以驗(yàn)證獲取序列的真實(shí)性。

樣品與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例