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技術(shù)簡介

      染色體步移(Chromosome walking)，又稱為基因組步移（Genome walking），是指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發(fā)，逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目標序列的方法。對于已經(jīng)完成基因組測序的模式生物種(如人、小鼠、線蟲、水稻、擬南芥等)，可直接從數(shù)據(jù)庫中輕松的找到已知序列的側(cè)翼序列。但是目前為止，自然界中大多數(shù)生物基因組DNA序列仍未知，要想知道一個已知區(qū)域兩側(cè)的DNA序列，染色體步移無疑是一種非常有效的方法。

      TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR)，即熱不對稱PCR，又叫巢式PCR，克服了傳統(tǒng)染色體步移法（如構(gòu)建文庫步移法、反向PCR法、連接接頭法等）操作復(fù)雜、非特異性擴增、連接效率低等弊端。其原理是，根據(jù)已知 DNA 序列，分別設(shè)計三條同向且退火溫度較高的特異性引物(SP Primer)，與經(jīng)過獨特設(shè)計的退火溫度較低的簡并引物進行熱不對稱 PCR 反應(yīng)。通常情況下，其中至少有一種兼并引物可以與特異性引物之間利用退火溫度的差異進行熱不對稱 PCR 反應(yīng)，一般通過三次巢式 PCR 反應(yīng)即可獲取已知序列的側(cè)翼序列。如果一次實驗獲取的長度不能滿足實驗要求時，還可以根據(jù)第一次步移獲取的序列信息，繼續(xù)進行側(cè)翼序列獲取。

應(yīng)用領(lǐng)域

1. 鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點，鑒定轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)致的外源基因的插入位點； （2）根據(jù)基因的已知片段、EST或插入的轉(zhuǎn)座子序列克隆目的基因，分離基因的啟動子及調(diào)控元件；

2. 用于人工染色體PAC、YAC和BAC的片段搭接；

3. 構(gòu)建圖位克隆中的重疊群；

4. 轉(zhuǎn)化標記輔助育種中的STS或SCAR標記等

服務(wù)內(nèi)容

服務(wù)流程

1.已知序列的驗證

根據(jù)客戶提供的已知序列設(shè)計引物，以材料的基因組DNA為模板進行PCR擴增，以驗證已知序列是否在模板中存在。

2. 5' 或3' 未知序列的獲取

根據(jù)已知序列設(shè)計3條高退火溫度的特異性下游或上游引物，同時使用低退火溫度的簡并引物,利用特異性引物與簡并引物之間退火溫度的差異進行不對稱PCR，通過三次巢式PCR獲取側(cè)翼序列。

3. 對獲取的序列進行驗證

獲取側(cè)翼未知序列后，我們將分別在已知和未知序列上設(shè)計引物進行PCR擴增并對PCR產(chǎn)物進行測序,以驗證獲取序列的真實性。

樣品與實驗結(jié)果

實驗結(jié)果示例