1 基本說明
BL21(DE3)菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體(如pET系列)的基因。λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶,該區(qū)整合于BL21的染色體上,所以稱為BL21(DE3)。可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶,用于pET系列,pGEX,pMAL等質粒的蛋白表達。BL21(DE3)感受態(tài)細胞由特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率達107cfu/μg DNA。
2 基因型:
F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm(DE3)
3 儲存及使用環(huán)境
本產品應保存在-80℃,不可反復凍融或放置時間過長,否則會降低轉化效率。
進行轉化過程中,請根據(jù)相應溫度及無菌條件的要求進行。
操作方法
1.BL21(DE3)感受態(tài)細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA(質粒或連接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打),冰中靜置25分鐘。
2.42℃水浴熱激90秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動會降低轉化效率。
3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB),混勻后37℃,200rpm復蘇60分鐘。
4.5000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。
注意事項
1. 感受態(tài)細胞最好在冰中緩慢融化,插入冰中8分鐘內加入目標DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉化效率。
2. 混入質粒時應輕柔操作。
3. 轉化高濃度的質??上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
4. 誘導時,IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。
5. 為獲得需要量的蛋白,最佳誘導時間,溫度,IPTG濃度需實驗者優(yōu)化。