基因型
F- mcrA?(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15?lacX74 recA1 rpsL (StrR) endA1 ?dcm uidA(DMluI)::pir-116?sbcC-sbcD
產(chǎn)品說明
GT115菌株,是專門用來克隆含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)或重復(fù)序列等DNA二級結(jié)構(gòu)的基因序列的大腸桿菌菌株。大腸桿菌中存在一種SbcCD蛋白復(fù)合體,可以識別DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu),并將其切除;將sbcC和sbcD兩個基因突變,增強(qiáng)了發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的穩(wěn)定性。同時在大腸桿菌基因組中引入uidA(DMluI)::pir-116,使GT115可以表達(dá) 兀 蛋白,含有R6Kg ori復(fù)制子的質(zhì)粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常復(fù)制。該菌株還含有具有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recA)突變,增強(qiáng)了外源DNA的穩(wěn)定性。GT115感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19檢測轉(zhuǎn)化效率>2×108 cfu/μg DNA。
操作方法
1. GT115感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA(質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底混勻(避免用槍吸打),冰中靜置25分鐘。
2. 42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰中并靜置2分鐘,晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。
3. 向離心管中加入0.9 mL室溫S.O.C.或LB培養(yǎng)基(S.O.C.營養(yǎng)豐富,可提高轉(zhuǎn)化效率)。
4. 37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
5. 5000 rpm離心1分鐘收菌,留取100 μl左右上清吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C. 或LB培養(yǎng)基上。
6. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。混入目的DNA時應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?;蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
2. 此菌株具有鏈霉素抗性,擁有這種抗性的質(zhì)粒無法使用。